Chelex-IOO结合盐析法胎儿绒毛组织进行进行亲子鉴定
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Chelex-IOO结合盐析法胎儿绒毛组织进行进行亲子鉴定

发表日期:2013-2-2 1 来源:湖南雅湘亲子鉴定咨询中心

目前,对直接从孕妇腹腔抽取的胎儿绒毛组织进行DNA提取的方法已经很成熟,但对于特殊案例,如从输卵管妊娠(宫外孕)组织中获取纯粹胎儿的DNA报道较少。笔者通过将输卵管妊娠组织中的绒
毛组织分离出来,联合采用Chelex-IOO和盐析法提取DNA,成功进行了STR分型。现报道如下。

1.3方法
1.3.1检材处理
    将输卵管妊娠组织用10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,连续切片(厚5 ym),HE染色。在光学显微镜
(xl0)目镜下,根据绒毛的结构,将与视野相对应的部位在玻片上用记号笔标出,然后将目镜切换至x20,
仔细确认最终的标记范围。将所标出的部位用干净的手术刀片轻轻刮取下来,置于1.5 mL离心管中(标为
管1)。同时,不在显微镜下观察,直接从一张切片中盲刮组织,置于另一个1.5 mL离心管中(标为管2。
1.3.2 DNA提取
    母亲血样采用Chelex-IOO法提取DNA。
    绒毛DNA的提取:在管1、管2中分别加入lmL二甲苯,56℃孵育10 min,以离心半径Scm,13 000 r/min,离心10 min,弃去上清液,重复以上步骤一次。加入1 mL冷无水乙醇,以离心半径5 cru,13 000 r/min,离心10 rriin,弃去上清液。加入ImL冷70%乙醇,以离心半径5 crri,13 000 r/min,离心10 ruin,弃去上清液,室温晾干后加入200 VL Chelex-100、10 VL蛋白酶K(20 mg/mL)振荡混匀,56℃水浴消化过夜,100℃孵育8 min,振荡混匀,以离心半径5 cm,13 000 r/min,离心5min后,吸取上清液于- 1.5mL离心管中立即置于冰上3 min,加300 VL STE[10 mmol/L Tris-Cl(pH=8.0),1 ruruol/L  EDTA (pH=8.0), 0.1mol/L  NaCl],20 VL蛋白酶K(20 mg/mL),56℃水浴消化。每隔24h补加一次蛋白酶K,水浴58 h后加入400 VL NaCl(4mol/L),冰浴10 min,以离心半径5 cm,13 000 r/min,离心10 min,吸取上清液于- 1.5mL离心管中,加入400VL冷的无水乙醇,-20℃放置3h,以离心半径Scm,13 000 r/min,离心10 min,弃去上清液。于沉淀中加入1.5mL冷70%乙醇,以离心半径5cm,13 000rhuin,离心5 min,弃去上清液,将残余液体室温晾干后加入30vL酌TE,用手指轻弹5min,离心后-20℃保存待用。
1.3.3 STR扩增及其分型
    采用Sinofilerni试剂盒,扩增体系为10 VL,DNA模板量为1斗L,在9700型PCR扩增仪上进行扩增,310型遗传分析仪电泳检测,GeneMapper ID v3.2分析软件进行分型。
2  结果与讨论
    以上方法获取的两管样本及母亲血样的STR检测结果见表1。15个STR基因座的分型结果表明,在
光学显微镜辅助下获取的绒毛组织经STR分型后,等位基因明确清晰,无杂峰干扰,而直接从切片中盲取的组织经分型后,在某些基因座,发现有两个以上等位基因,此结果提示为胎儿绒毛和母体组织的混合基因型。对于手术切除的输卵管妊娠组织,由于怀孕时间短,胚胎很小,肉眼无法将胎儿和母体组织区分开来,这时可以进行病理切片后借助光学显微镜,有针对性地选取所需要的胎儿绒毛组织,从而保证了所提取的DNA是单一的绒毛组织而不会混有母体成分。
    表1绒毛组织及血样的STR检验结果
  基因座    管1    管2    母亲血样
  D8.S//79    12, 14    12,14,15    12.15
  D2/.S//    30,32.2  30, 30.2, 32.2  30.2, 32.2
  D7.S820    8.12    8 ,12    8,12
  C.SFIP0    10,11    10, 11    10 .10
  D3.S1358    15 ,15    15 ,17    15 .17
  D5.S818    11,12    11 ,12    11 .12
  D135317    10 ,11    10,11,13    11.13
  D/65539    9.12    9,12    12.12
  D2.S1338    17 ,20    17 ,20,23    17 .23
  D19.S433    12, 14.2  12, 14.2    12, 14.2
  vWA    17 ,19    17,18,19    18 .19
  D1253 91    18 ,22    18 ,22    18 .22
  D/8.S5/    14,17    14 ,15 ,17    15 .17
  D6.S1043    14,21    12 ,14,21    12 .21
  FGA    22,24  21,22,24    21.22
    目前,对于经过甲醛固定、石蜡包埋的组织,文献多用有机溶剂提VX [2-3],此方法虽然也能获得理想的分型效果,但往往需要含有足量的DNA且因为厦复抽提造成DNA损失严莺。另外,如果有机溶剂去除得不干净,也会抑制PCR的效果,所以并不适合病理切片中微量DNA的提取。本研究用Chelex-IOO结合盐析法取得了满意的效果,Chelex-IOO法能够最大程度地获得微量组织的DNA,但是杂质较多:而盐析法是基于DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解而使杂质沉淀,从而达到了DNA纯化的目的。

关键词: 亲子鉴定  DNA亲子鉴定  胎儿亲子鉴定


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